SHuffle T7 Express lysY Chemically Competent Cell

大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞

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【常見(jiàn)問(wèn)題】：貴司提供三款SHuffle T7化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，如何選擇呢？

基于兩種不同的大腸桿菌菌株，有兩個(gè)版本的SHuffle T7菌株。SHuffle T7（貨號(hào)：MF2291）是基于大腸桿菌K12改造，而SHuffle T7 Express lysY（貨號(hào)：MF2289）和SHuffle T7 Express E. coli B（貨號(hào)：MF2290）是基于大腸桿菌B菌株改造。我們發(fā)現(xiàn)，相同蛋白在不同菌株中的折疊和表達(dá)水平都有差異，目前來(lái)說(shuō)，無(wú)法直接預(yù)測(cè)哪款菌株能更成功的折疊某一款既定的含二硫鍵蛋白。因此，我們建議客戶在初次實(shí)驗(yàn)中，可自行比較目的蛋白在不同菌株中的表達(dá)，從而選擇更適合的菌株。一旦確定好菌株后，再進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化（比如：溫度、誘導(dǎo)強(qiáng)度和時(shí)間等）。。

所有的Shuffle菌株都能用于非T7啟動(dòng)子（比如：lac和ara啟動(dòng)子表達(dá)載體）。對(duì)于T7啟動(dòng)子表達(dá)載體，建議要么選擇SHuffle T7（貨號(hào)：MF2291）或SHuffle T7 Express E. coli B（貨號(hào)：MF2290）。對(duì)于毒性T7啟動(dòng)子表達(dá)，建議選擇SHuffle T7 Express lysY（貨號(hào)：MF2289）。

菌株描述：

SHuffle T7 Express lysY菌株是SHuffle T7 ExpressE. coliB的衍生菌株，特別設(shè)計(jì)以增強(qiáng)含多個(gè)二硫鍵蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的正確折疊，并且降低本底表達(dá)，適合于T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的蛋白表達(dá)。

SHuffle T7 Express lysY菌株含lysY質(zhì)粒（氯mei素抗性），這個(gè)質(zhì)粒含表達(dá)T7溶菌mei的基因，能夠降低目的基因的背景表達(dá)水平，同時(shí)不干擾IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)，適合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表達(dá)。SHuffle T7 Express lysY菌株的染色體中整合一個(gè)拷貝的二硫鍵異構(gòu)酶基因—DsbC，促進(jìn)錯(cuò)誤氧化的蛋白轉(zhuǎn)化為正確形式。另外，細(xì)胞質(zhì)中的DsbC也是一個(gè)分子伴侶，能協(xié)助不含二硫鍵蛋白的正確折疊。該菌株缺少Lon蛋白酶和OmpT蛋白酶，可減少對(duì)重組蛋白的降解。

SHuffle T7 Express lysY菌株染色體中整合一個(gè)拷貝的T7 RNAP基因，可以表達(dá)噬菌體T7 TNA聚合酶，從而適用于T7啟動(dòng)子誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)。該菌株還能表達(dá)大腸桿菌RNA聚合酶，所以可用于pET系列，pGEX，pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達(dá)。SHuffle T7 Express lysY菌株具抵抗噬菌體T1（fhuA2）感染的特點(diǎn)，具鏈mei素、壯觀emi素和氯emi素抗性。

SHuffle T7 Express lysY菌株基因型：MiniF lysY (CamR) /fhuA2 lacZ::T7 gene1 [lon] ompT ahpC gal λatt::pNEB3-r1-cDsbC (SpecR, lacIq) ΔtrxB sulA11 R(mcr-73::miniTn10--TetS)2 [dcm] R(zgb-210::Tn10 --TetS) endA1 Δgor Δ(mcrC-mrr)114::IS10

產(chǎn)品描述

本品是SHuffle T7 Express lysY菌株經(jīng)特殊工藝制作所得的感受態(tài)細(xì)胞，可用于DNA的熱擊轉(zhuǎn)化。經(jīng)pUC19載體檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>1×108cfu/μg DNA。且在-80℃能穩(wěn)定保存幾個(gè)月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。

產(chǎn)品組分：

保存與運(yùn)輸條件：

保存：-80℃保存，六個(gè)月有效。

運(yùn)輸：干冰運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1） 感受態(tài)細(xì)胞必須用干冰運(yùn)輸。感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)在-80℃保存（避免溫度波動(dòng)），不可反復(fù)凍融且放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)減低感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。

2） 最好在冰上緩慢融化感受態(tài)細(xì)胞。不可在冰上放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

3） 進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作時(shí)，需在相應(yīng)溫度及無(wú)菌條件下進(jìn)行。

4） 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。

5） 為防止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不成功，可保留部分連接反應(yīng)液以重新轉(zhuǎn)化，將損失降到zui低。

6） 產(chǎn)品包裝內(nèi)含載體pUC19 DNA(10pg/μl)，供對(duì)照實(shí)驗(yàn)用

7） SHuffle T7 Express lysY菌株具鏈mei素、壯觀emi素、氯emi素抗性，不可用于具鏈emi素、壯觀emi素和氯emi素抗性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。

8） 為獲得需要量的蛋白，最佳誘導(dǎo)時(shí)間、溫度、IPTG濃度（0.1~10mM）都需進(jìn)行優(yōu)化。

9） 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法

1） 從-80℃冰箱取出取感受態(tài)細(xì)胞，迅速置于冰浴中，5min后待菌塊融化，加入目的質(zhì)粒，用手輕彈管底輕輕混勻（避免用槍吹打），冰浴靜置25min。

2） 42℃水浴熱激45s，迅速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冰上靜置2min。此過(guò)程不要搖動(dòng)離心管。

3） 向每個(gè)離心管中加入700 μl無(wú)菌的LB培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后置于37℃ 搖床，200 rpm振蕩培養(yǎng)60min，目的使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。

4） 低速離心收菌（比如5000rpm，1min），留取50-100μl左右上清，用槍輕輕吹打重懸菌塊，之后加到含相應(yīng)抗生素的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無(wú)菌的涂布棒將細(xì)胞均勻涂開(kāi)，將平板置于室溫（或37℃）直至液體被吸收，之后倒置放于37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

【注意】：

a）涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)調(diào)整。若轉(zhuǎn)化的DNA總量較多，可不用離心，直接取少量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板；反之，若轉(zhuǎn)化的DNA總量較少，則通過(guò)離心（5,000 rpm，1min）后吸除部分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其涂布于一個(gè)平板中。

b）新制備的固體培養(yǎng)基不易涂干，可將平板正置于37℃直至液體被吸收后再倒置培養(yǎng)。

c）涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過(guò)少，可以將剩下的菌液再涂布新培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

相關(guān)產(chǎn)品：

附表1固體和液體LB培養(yǎng)基配方

附表2 固體和液體2-YT培養(yǎng)基配方

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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